铁皮石斛鉴别(鉴别铁皮石斛好坏)

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 CN 114438240 A(43)申请公布日 2022.05.06(21)申请号 2.0(22)申请日 2021.12.31(71)申请人 浙江寿仙谷医药股份有限公司地址 321000 浙江省金华市武义县壶山街道商城路10号申请人 浙江寿仙谷植物药研究院有限公司(72)发明人 李振皓李明焱王瑛李振宇徐靖史月姣李建淼(74)专利代理机构 杭州浙科专利事务所(普通合伙) 33213专利代理师 刘元慧(51)Int.Cl.C12Q 1/6895 (2018.01)C12Q 1/6858 (2018.01)C12N 15/11 (2006.01)权利要求书1页 说明书5页 附图2页(54)发明名称一种铁皮石斛高分辨率熔解曲线鉴别引物、 应用及鉴别方法(57)摘要本发明一种铁皮石斛高分辨率熔解曲线鉴 别引物、应用及鉴别方法，上游引物TPHML‑F的核 苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，下游引物TPHML‑R 的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。本鉴别引物 可用于鉴别铁皮石斛药材及其加工制品铁皮枫 斗与其近缘物种。

本发明方法操作简便、耗时短、 检出限低、准确度高，具有良好的应用前景。 A0 4 2 8 3 4 4 1 1N C CN 114438240 A权利要求书1/1 页1.一种用于鉴定铁皮石斛的特异性分子标记TPHML，其特征在于该分子标记包括上游 引物TPHML‑F和下游引物TPHML‑R，所述上游引物TPHML‑F的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所 示；所述下游引物TPHML‑R的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。2.一种鉴定铁皮石斛的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括分子标记TPHML，该分 子标记包括上游引物TPHML‑F和下游引物TPHML‑R，所述上游引物TPHML‑F的核苷酸序列如 SEQ IDNO.1所示；所述下游引物TPHML‑R的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。3.权利要求1所述引物对或权利要求2所述试剂盒在鉴定铁皮石斛真伪和掺伪中的应 用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述铁皮石斛包括铁皮石斛药材及其加工 制品铁皮枫斗。5.一种利用高分辨熔解曲线分析技术鉴定铁皮石斛的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）提取待检测样本的DNA；2）以待检测样本的DNA为模板DNA，与分子标记TPHML混合后进行PCR扩增；3）高分辨熔解曲线分析：PCR扩增完成后进入高分辨率熔解曲线分析程序，若待测样品 Tm值为75.75±0.04℃，则为铁皮石斛。

6.根据权利要求5所述的一种利用高分辨熔解曲线分析技术鉴定铁皮石斛的方法，其 特征在于步骤1）中，取待检测样品的量为20‑100mg，用高通量组织研磨仪研磨后，使用两步 CTAB法提取样品总DNA，稀释，得模板DNA。7.根据权利要求5所述的一种利用高分辨熔解曲线分析技术鉴定铁皮石斛的方法，其 特征在于步骤2）中PCR扩增反应程序包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火40s，72 ℃延伸40s，40个循环；72℃再延伸7min。8.根据权利要求5所述的一种利用高分辨熔解曲线分析技术鉴定铁皮石斛的方法，其 特征在于步骤2）中PCR扩增反应体系以20μL计，包括：2 ×High ResolutionMelting MasterMix 10μL，MgCl （2.5mmol/L）1.6μL，引物（10μmol/L）各0.4μL，模板DNA 1μL，ddH O22 6.6μL。9.根据权利要求5所述的一种利用高分辨熔解曲线分析技术鉴定铁皮石斛的方法，其‑1 特征在于步骤3）中高分辨率熔解曲线分析程序包括：以0.02℃ ·s 速度由70℃升温至90 ℃，每升高1℃采集荧光25次。

10.根据权利要求8所述的一种利用高分辨熔解曲线分析技术鉴定铁皮石斛的方法，其‑1‑1 特征在于所述模板DNA浓度为1ng ·μL ～100ng ·μL 。22 CN 114438240 A说明书1/5 页一种铁皮石斛高分辨率熔解曲线鉴别引物、应用及鉴别方法 技术领域 [0001] 本发明属于铁皮石斛分子鉴别技术领域，具体涉及一种铁皮石斛高分辨率熔解曲 线鉴别引物、应用，以及利用该引物鉴别铁皮石斛真伪与掺伪的方法。 背景技术 [0002] 石斛，被道家医学经典《道藏》列为“中华九大仙草”之首，始载于《神农本草经》，被 列为上品。现代临床研究发现石斛中的多糖和甘露糖等具有抗高血压、增强免疫力的作用， 亦可治疗慢性咽炎、消化系统疾病等，效果十分明显。全球的石斛属植物约1500种，属下所 有种均被列入《濒危野生动植物国际贸易公约》附录，我国的石斛种类仅占全球约5％，而其 中具有药用价值的铁皮石斛、金叉石斛等均被列入国家重点保护野生药材物种名录，为国 家III级保护药材。2020年版《中国药典》一部收载了5个石斛品种，其中金叉石斛、霍山石 斛、鼓槌石斛、流苏石斛及其同属植物近似种均列为“石斛”项下，而铁皮石斛则单列为“铁 皮石斛”。

铁皮石斛为兰科植物铁皮石斛DendrobiumofficinaleKimuraetMigo的干燥 茎，因其表皮呈现铁青色而得名，以茎入药，具有独特的药用价值，是传统的名贵中药材，有 着极高的药用价值。由于铁皮石斛繁殖慢，再加上无节制的采摘，造成野生资源稀缺，野生 资源已经基本灭绝，被列入《中国植物红皮书》，已成为濒危珍稀药材；又因其同属和同科近 属植物形态相近，市场混淆品和伪品众多，其加工品铁皮枫斗亦常被其他枫斗类药材伪充。 因此，亟需开发一种鉴别铁皮石斛药材及其加工品铁皮枫斗真伪与掺伪的方法。 [0003] 高分辨率熔解曲线分析(highresolutionmeltinganalysis，HRM)是一种基于 实时荧光定量PCR技术结合荧光燃料，分析其PCR产物的熔解曲线变化得出实验结论。不同 PCR产物因含有细微不同GC含量、不同碱基排列，从而导致产物Tm值存在差异，所表达出的 荧光信号强度不同，可以得出序列间的不同。单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解 曲线的基因分析新技术，无需使用序列特异性探针，而是利用一种饱和燃料对PCR反应产物 进行分析，具有极高的敏感性，可以检测出单个碱基的差异，并且成本低、高通量、速度快、 结果准确、不受检测位点的局限。

发明内容 [0004] 针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种铁皮石斛高分辨率熔解 曲线鉴别引物，以及利用该引物鉴别铁皮石斛真伪与掺伪的方法。具体通过以下技术方案 加以实现: [0005] 本发明的第一方面，提供了一组用于铁皮石斛高分辨率熔解曲线鉴别引物，该鉴 别引物为TPHML，核苷酸序列如下： [0006] 上游引物TPHML‑F：CATCCCATCCATCTGGAAATCT，如SEQ IDNo.1所示； [0007] 下游引物TPHML‑R：AACAATCGCAAGAAATGCAAAG，SEQ IDNo.2所示。 [0008] 上述引物是通过利用BioEdit软件对GeneBank数据库中铁皮石斛及其同属近源物 种的matK序列进行同源比对，并辅以人工校对，分析得出铁皮石斛与近缘石斛物种稳定的33 CN 114438240 A说明书2/5 页 差异SNP位点，基于PrimerPrmier5.0软件设计铁皮石斛高分辨率熔解曲线鉴别引物，再验 证不同产地铁皮石斛药材及其加工制品铁皮枫斗样品的Tm值是否为75.75±0.04℃。因此， 本发明所述引物对具有极高的专一性，用它们对铁皮石斛药材及其加工品铁皮枫斗样品 DNA进行PCR 扩增后进行HRM分析，只有铁皮石斛药材及其加工制品铁皮枫斗的Tm值为 75.75±0.04℃，而其他混伪品的Tm值为76.53±0.06℃。

[0009] 本发明的第二方面，提供了一种鉴定铁皮石斛的试剂盒，所述试剂盒中包括上述 引物对。 [0010] 本发明的第三方面，提供了一种上述引物对或上述试剂盒在鉴别铁皮石斛真伪与 掺伪中的应用。 [0011] 进一步地，所述铁皮石斛包括铁皮石斛药材及其加工制品铁皮枫斗。 [0012] 本发明的第四方面，提供了一种利用高分辨熔解曲线分析技术鉴别铁皮石斛真伪 与掺伪的方法，包括以下步骤：提取待检测样本的DNA；以待检测样本的DNA为模板DNA，与上 述引物对或上述试剂盒中的引物对混合后进行PCR扩增；PCR完成后进入高分辨率熔解曲线 分析程序，若待测样品Tm值为75.75±0.04℃，则为铁皮石斛，所述待测样品包括铁皮石斛 药材及其加工制品铁皮枫斗。 [0013] 进一步地，本发明对所述待测样品的DNA提取方法并没有特殊限定，优选采用CTAB 法提取。 [0014] 进一步地，在本发明中，所述待测样品的DNA提取方法优选，取待测样品20‑100mg， 用高通量组织研磨仪研磨后，使用两步CTAB法提取样品总DNA，稀释，得模板DNA。 [0015] 进一步地，所述PCR扩增反应程序包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火 40s，72℃延伸40s，40个循环；72℃再延伸7min。

[0016] 进一步地，在本发明中，所述PCR扩增反应体系以20μL计，包括：2 ×High ResolutionMeltingMasterMix 10μL，MgCl (2.5mmol/L)1.6μL，引物(10μmol/L)各0.42 μL，模板DNA 1μL，ddH O6.6μL。2 [0017]‑1‑1进一步地，在本发明中，所述模板DNA浓度为1ng ·μL ～100ng ·μL 。 [0018] 本发明所述PCR扩增后，还包括对PCR扩增产物进行HRM分析；所述HRM分析程序包‑1 括：以0.02℃ ·s 速度由70℃升温至90℃，每升高1℃采集荧光25次。若待测样品Tm值为 75.75±0.04℃，则为铁皮石斛，否则为铁皮石斛混伪品。 [0019] 本发明具有以下有益效果： [0020] 1)本发明的高分辨率熔解曲线鉴别引物TPHML‑F/R可从铁皮石斛及其近缘石斛物 种中进行铁皮石斛和其加工制品铁皮枫斗真伪与掺伪鉴别，引物具有极高的专一性，方法 简单，成本低，高效，结果准确，不受检测位点限制； [0021] 2)当铁皮石斛及其加工制品铁皮枫斗掺伪混合样品中掺伪品DNA浓度≥1％时， 本发明方法均可准确检测出掺伪品，检测限低，具有良好的应用前景； [0022] 3)本发明方法不受样品DNA浓度影响，稳定性好，当样品DNA浓度范围1～100ng · ‑1 μL 时，铁皮石斛与常见石斛属混伪品以及铁皮枫斗与其他枫斗类药材混伪品均能被准确 鉴别。

44 CN 114438240 A说明书3/5 页 附图说明 [0023] 图1为不同引物与模板DNAPCR扩增后对铁皮石斛及混伪品Tm值的影响； [0024] 图2为铁皮石斛标准HRM熔解曲线图； [0025] 图3不同DNA浓度的铁皮石斛与混伪品HRM差分曲线图；图3(A)为DNA浓度为1ng · ‑1‑1 μL 的铁皮石斛与混伪品HRM差分曲线图；图3(B)为DNA浓度为5ng ·μL 的铁皮石斛与混‑1 伪品HRM差分曲线图；图3(C)为DNA浓度为25ng ·μL 的铁皮石斛与混伪品HRM差分曲线图；‑1 图3(D)为DNA浓度为50ng ·μL 的铁皮石斛与混伪品HRM差分曲线图；图3(E)为DNA浓度为‑1 100ng ·μL 的铁皮石斛与混伪品HRM差分曲线图； [0026] 图4为不同浓度比例铁皮石斛混伪品DNA与铁皮石斛样品DNA混合作为模板的曲线 图；图4(A)为不同浓度比例铁皮石斛混伪品DNA 与铁皮石斛样品DNA混合作为模板的归一 化曲线图；图4(B)为不同浓度比例铁皮石斛混伪品DNA与铁皮石斛样品DNA混合作为模板的 差分曲线图； [0027] 图5为铁皮石斛与混伪品鉴别的曲线图；图5(A)铁皮石斛与混伪品鉴别的熔解曲 线图；图5(B)铁皮石斛与混伪品鉴别的归一化曲线图；图5(C)铁皮石斛与混伪品鉴别的差 分曲线图。

具体实施方式 [0028] 以下结合说明书附图对本发明做进一步详细描述，以便更好地理解本技术方案。 [0029] 本发明利用BioEdit软件对GeneBank数据库中铁皮石斛及其同属近源物种的matK 序列进行同源比对，并辅以人工校对，分析得出铁皮石斛与近缘石斛物种稳定的差异SNP位 点，基于PrimerPrmier5.0软件设计2对铁皮石斛高分辨率熔解曲线鉴别引物，引物序列及 退火温度见表1。 [0030] 表1 引物序列及退火温度 [0031] [0032] 为考察表1中2对引物在鉴别铁皮石斛与其近缘石斛物种混伪品时的差异显著性， 本发明对表1中的2对引物进行PCR扩增及HRM分析，并对其峰形和Tm值进行分析，结果显55 CN 114438240 A说明书4/5 页 示，引物TPHML‑1F/R 扩增后，铁皮石斛样品Tm值为74.99±0.11℃，混伪品样品Tm值为 75.87±0.12℃；引物TPHML‑2F/R扩增后，铁皮石斛样品Tm值为75.75±0.04℃，混伪品样品 Tm值为76.53±0.06℃，混伪品样品Tm值更加集中，与铁皮石斛Tm值差异更加显著，如图1所 示。

因此，本发明优选引物TPHML‑2F/R作为本发明所述一组铁皮石斛高分辨率溶解曲线鉴 别引物。 [0033] 为构建铁皮石斛标准高分辨率熔解曲线模型，本发明对30份不同产地的铁皮石斛 药材及12份铁皮石斛枫斗样品提取DNA，并利用Roche480Ver.1.2软件进行HRM分析，并据 此建立铁皮石斛标准高分辨率熔解曲线模型，其中荧光采集值低于最大值60％的样品不列 入分析范围。结果显示，获得的铁皮石斛标准高分辨率熔解曲线模型中曲线峰形一致，均为 单峰，其Tm值均为75.75℃，标准偏差为0.04，见图2。 [0034] 为考察本发明方法的稳定性，本发明分别将铁皮石斛与常见石斛属混伪品的DNA‑1‑1‑1‑1‑1 模板依次稀释为100ng ·μL 、50ng ·μL 、25ng ·μL 、5ng ·μL 、1ng ·μL ，PCR扩增后进‑1 行HRM差分曲线分析。结果显示，DNA模板浓度范围在1～100ng ·μL 时，铁皮石斛与常见石 斛混伪品均能被准确分型，曲线形状差异大，且样品DNA浓度低时更稳定，见图3。提示，本发 明所述一种利用高分辨溶解曲线分析技术鉴定铁皮石斛的方法稳定性较好。

[0035] 为考察本发明方法对掺伪样品中伪品的检出能力，本发明将常见石斛属混伪品 DNA按照0％、1％、5％、25％、50％、99％、100％的浓度比例与铁皮石斛样品DNA混合作为DNA 模板，利用本发明所述一组铁皮石斛高分辨率熔解曲线鉴别引物扩增后进行基因分型分 析。结果显示，当混合样品中铁皮石斛混伪品DNA浓度含量仅为1％时，即可通过基因分型与 铁皮石斛正品区分开，随铁皮石斛混伪品DNA浓度含量增高，与铁皮石斛的差异越大；当掺 伪混合样品中伪品DNA浓度≥1％时，本发明方法均可准确检测出伪品，见图4。提示，本发明 所述一种利用高分辨熔解曲线分析技术鉴定铁皮石斛的方法对铁皮石斛掺伪品具有良好 的检出效果。 [0036] 实施例1：一种利用高分辨熔解曲线技术鉴定铁皮石斛的方法实验材料：本实施例 中采用的铁皮石斛来自产寿仙谷有机国药养生基地的仙斛2号。 [0037] 本实施例中采用的7种常见石斛属混伪品分别为金钗石斛 (Dendrobium nobileLindl.)、霍山石斛(Dendrobium huoshanenseC.Z.TangetS.J.Cheng)、鼓槌石斛 (Dendrobium chrysotoxumLindl.)、流苏石斛(DendrobiumfimbriatumHook.)、广东石斛 (DendrobiumwilsoniiRolfe.)、杯鞘石斛(Dendrobium gratiosissimumRchb.f.)、束花 石斛(Dendrobium chrysanthumLindl.)、齿瓣石斛(DendrobiumdevonianumPaxt.)。

[0038] 实验方法 [0039] (1)待测样品DNA提取：取铁皮石斛原植物及7种常见石斛属混伪品20‑100mg，用高 通量组织研磨仪研磨后，使用两步CABT法提取样品总DNA，利用美国Thermo公司NanoDropTM‑1‑1 one型超微量紫外‑可见光分光光度计检测DNA浓度，然后稀释至100ng ·μL 、50ng ·μL 、‑1‑1‑1 25ng ·μL 、5ng ·μL 、1ng ·μL ，得模板DNA，4℃冰箱放置备用。 [0040] (2)引物设计与合成：利用BioEdit软件对GeneBank数据库中铁皮石斛及其同属近 源物种的matK序列进行同源比对，并辅以人工校对，分析得出铁皮石斛与近缘石斛物种稳 定的差异SNP位点，基于PrimerPrmier5.0软件设计铁皮石斛高分辨率熔解曲线鉴别引物， 上游引物TPHML ‑F：5’‑CATCCCATCCATCTGGAAATCT ‑3’和下游引物TPHML ‑R：5’‑66 CN 114438240 A说明书5/5 页 AACAATCGCAAGAAATGCAAAG‑3’，合成引物。 [0041] (3)引物对(TPHML‑F/R)的PCR扩增：将模板DNA样品与引物对(TPHML‑F/R)混合后， 在LightCycler480型荧光定量PCR仪上进行PCR扩增及高分辨率熔解曲线分析。

[0042] PCR扩增反应体系(总体积20μL)：2 ×HighResolutionMelting MasterMix 10μ L，MgCl (2.5mmol/L)1.6μL，上游引物(10μmol/L)0.4μL，下游引物(10μmol/L)0.4μL，模板2 DNA 1μL，ddH O 20μL。2 [0043] PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火40s，72℃延伸 40s，40个循环；72℃再延伸7min。 [0044] (4)高分辨率熔解曲线分析：引物对(TPHML‑F/R)的PCR扩增完成后，利用Roche 480Ver.1.2软件进行HRM分析，其中分析程序为：以0.02℃/s速度由70℃升温至90℃，每升 高1℃采集荧光25次。 [0045] 实验结果，见图5A，铁皮石斛与7种混伪品熔解曲线均为单峰，但峰位置具有明显 差异，铁皮石斛Tm值为75.75±0.04℃，混伪品样品Tm值为76.53±0.06℃。 [0046] 本申请为了排除样品DNA浓度对鉴别结果的影响，将熔解曲线进行归一化处理及 差分分析，结果显示，铁皮石斛与混伪品的归一化曲线与差分曲线形状差异显著，见图5B， 5C，提示，熔解曲线、归一化曲线和差分曲线均可准确区分铁皮石斛与常见石斛混伪品。77 CN 114438240 A说明书附图1/2 页图1图288 CN 114438240 A说明书附图2/2 页图3图4图599