胃壁的四层结构(胃的壁层)

空间转录组实验包括样本制备、组织透化优化、基因表达三个主要部分，其中样本制备是指对新鲜组织样本进行速冻及OCT包埋，速冻是为了保证新鲜组织中RNA不被降解，而OCT包埋是为了在后续冰冻切片过程中可以支撑组织，增加组织的连续性，减少皱折及碎裂，以保证组织结构的完整性。而基因表达是空间转录组的正式实验部分，通过检测不同空间区域的基因表达信息在分子水平上解析组织空间异质性。

在空间基因表达实验前，首先要进行组织透化优化。顾名思义，就是对组织透化条件进行摸索，找到最优的组织透化时间。这一步骤需要使用专门的组织透化芯片，此芯片包含8个捕获区域。

具体原理及流程：

01 冷冻切片固定在组织优化芯片的相应区域；

02 HE 染色及成像；

03 在组织透化酶的作用下，细胞释放RNA，并被荧光探针捕获；

04 被捕获的mRNA形成带有荧光标签的 cDNA，随即通过荧光成像结果判定最佳透化时间。

图1 组织透化优化实验流程

你或许会问，这不就是预实验吗？省掉这步行不行？答案是否定的。

不同物种不同器官甚至同一组织的不同部位样本异质性都极强。空间转录组技术的魅力也正是因为它可以在转录水平上解析这种异质性。以人类组织为例，细胞和细胞间质共同组成了人类的四大组织类型，包括上皮组织、肌肉组织、神经组织、结缔组织，其中上皮组织和结缔组织分类组成最为复杂，往往使空间转录组组织透化难度增加的始作俑者就是这两类组织。

图2 组织分类

上皮组织根据结构和功能可分为两类，包括被覆上皮和腺上皮，其中被覆上皮主要覆盖于体表或衬于体内各种管、腔及囊的内表面；腺上皮是构成腺的主要成分。被覆上皮又可根据上皮细胞的排列层次和细胞形态分为单层上皮和复层上皮两类。

结缔组织主要由细胞、纤维、以及大量细胞基质构成，其中细胞间质包括液态、胶体状或固态的基质、细丝状的纤维和组织液，细胞包括成纤维细胞、浆细胞等，而纤维包括胶原纤维、弹性纤维、网状纤维。结缔组织按结构和功能可分为疏松结缔组织、致密结缔组织、脂肪、软骨、骨、血液等。结缔组织中细胞种类多、数量少、分散而无极性，肌腱、韧带、声带等空间转录组实验中的“顽固分子”都属于此种组织类型。而软骨、骨等组织更是空转实验短期无法解决的组织类型。

复杂多样的组织类型就是空间透化的终极难度了吗？组织样本在绝大多数情况下都是由多种组织类型构成的，如皮肤样本、表皮是由角化的复层扁平上皮构成，而真皮由致密结缔组织构成。两种都比较难透化的组织类型组合在一起，导致皮肤样本成为了空间转录组啃不下来的“硬骨头”之一。

图3 皮肤组织结构

再如胃壁组织，其共分四层，自内向外依次为粘膜层、粘膜下层、肌层和外膜层。胃粘膜层即胃壁的内层，它是由柱状上皮组成，粘膜下层由疏松结缔组织和弹性纤维组成。肌层由三层平滑肌组成。浆膜层即胃的外壁，由单层扁平上皮和结缔组织构成。复杂的结构也导致这种样本类型透化起来十分困难。

正常组织的结构就已如此复杂，何况通常我们感兴趣的组织可能还包括癌变、纤维化等类型的非正常组织。

综上所述，使用固定的组织透化时间和透化试剂就妄图解决所有的组织类型是不切实际的，透化条件的摸索就显得尤为重要。针对组织透化，10x Genomics Visium提供了标准的组织透化流程，通过组织透化芯片摸索不同透化时间来解决大部分样本类型的透化问题，还有一部分样本的透化使用标准protocol并没有很好的效果，RNA不能通过透化释放出来，后续的基因表达检测结果自然会出现基因检出数低，reads丰度低以及基因组mapping率低等一系列问题。

博奥晶典作为空间转录组行业的先行者一直在探索不同组织样本类型的透化方法。现已针对肝脏、胃、结直肠、肌腱、滑膜等难透化组织针对性开发了相应的透化方法。

图5 特殊样本改良透化法

参考文献：[1] 马丽娟，宋瑞佳，刘雪来主编，人体解剖生理学基础，西安交通大学出版社，2015.06, 35-41[2] 钟树志，彭彦霄主编，组织学与胚胎学，中国科学技术大学出版社，2015.08, 11-16[3] 邹仲之，李继承，组织学与胚胎学（第八版）[M]．北京：人民卫生出版社，2013: 21

博奥晶典空间转录组测序

博奥晶典作为国内第一批引进10x Genomics平台的公司，率先搭建了完善的空间转录组实验平台。目前已经完成了200多个样品、50多种不同样品类型的服务，覆盖的物种和样品类型包括人和小鼠的脑、眼球、口腔、心脏、肝脏、肺脏、肾脏、肠、胃、卵巢、前列腺等，在空间转录组测序方面具有丰富的项目经验。

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