毛雨(毛雨欣)

肿瘤类器官作为重要的体外细胞模型为肿瘤药物研究提供了新的工具，相比于传统的2D培养的肿瘤细胞系，3D培养的类器官可以更好地维持癌症患者的肿瘤特征，反映肿瘤内部的异质性。因此，基于类器官模型的药物筛选不仅可以发现新的肿瘤治疗药物，还可以用于探究不同突变类型细胞的药物敏感性差异。尽管基于肿瘤类器官的药物筛选助力了靶向药物研究，但是目前药物筛选的评价标准主要是基于增殖和凋亡等细胞表型特征，对药物的作用机制少有分子层面的深入解析。

北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）汤富酬课题组与北京大学第三医院普通外科付卫团队合作，成功建立了基于人类结直肠癌类器官模型的体外药物筛选和药效评价平台，采用“老药新用”的策略，使用小分子药物体外筛选手段并经过免疫缺陷小鼠体内移植实验验证，得到多种具有潜在结直肠癌治疗价值的候选药物，并在转录组水平对候选药物的作用机制进行深入解析（图1）。该研究成果于2023年6月22日以Drug repurposing screening and mechanism analysis based on human colorectal cancer organoids为题在线发表在Protein & Cell上。

图1 实验设计方案示意图

该研究的主要发现有：

1.结合药物预测方法进行基于结直肠癌类器官的药物筛选，在335种FDA批准的治疗其他疾病的临床药物中，筛选得到34种潜在靶向结直肠癌的候选药物。

该研究首先利用转录组、外显子组和DNA甲基化组测序技术，在多组学水平上对结直肠癌类器官的分子特征进行解析、对肿瘤类器官与患者原位肿瘤的一致性进行评估。通过对比发现，该研究构建的结直肠癌类器官可以很好地保留原位肿瘤组织的突变特征、重要信号通路的表达水平以及基因启动子区域的甲基化水平。值得一提的是，该研究构建的8个结直肠癌类器官中有3个携带有KRAS突变，KRAS突变是结直肠癌中最常见的突变之一，突变频率约为30%-50%。该研究中的结直肠癌类器官同时囊括了带有KRAS突变和不含KRAS突变的肿瘤类型，具有很好的代表性，能够更好地体现各种亚型结直肠癌的肿瘤特征。

为了能够筛选到毒副作用小且具有潜在的杀伤结直肠癌细胞的药物，除了使用经过FDA批准的治疗其他疾病的药物库外，该研究利用已有数据库进行条件严格的药物预测，并且使用结直肠癌临床常用药5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil）和瑞戈非尼（Regorafenib）作为阳性对照。筛选结果显示，在包含预测药物的共335种药物中，34种药物具有潜在杀伤结直肠癌类器官的能力（图2）。

为了进一步确认筛选到的34种药物对不同患者来源的结直肠癌类器官的杀伤效果，该研究在8个结直肠癌类器官系中对药物效果进行测试（图2）。研究结果发现，不同患者来源的类器官对34种候选药物的敏感性不同，临床上常用的5-氟尿嘧啶和瑞戈非尼两种结直肠癌治疗药物也显示出对不同的类器官系的敏感性不同，说明不同患者之间的药物响应差别大，这说明使用类器官筛选药物进而帮助指导患者用药的重要性。

图2. 基于类器官的药物筛选体系的建立和药物筛选结果

2.依据转录组特征将结直肠癌类器官对有效的34种候选药物的响应分为五种模式：促分化类、抑生长类、抑代谢类、促免疫响应类和抑细胞周期类。

为了进一步探究筛选得到的34种候选药物的作用机制，该研究分别对不同患者来源的肿瘤类器官进行药物处理，收集药物处理后的类器官样本进行转录组测序，在肿瘤相关信号通路的干扰、结直肠癌肿瘤特征基因表达、肿瘤耐药相关基因表达以及细胞分化干性四个方面对34种药物的作用机制进行系统的揭示。

首先，该研究通过基因集富集分析探究药物处理后类器官的细胞增殖、免疫激活、应激及代谢等肿瘤相关通路的表达情况。结果发现，尽管筛选出的药物都可以抑制肿瘤类器官的细胞活力，但从转录组水平上看，不同药物干扰的细胞信号通路不同，说明不同药物的作用方式不同，主要区分为5个类群，结合肠道上皮细胞标志基因的表达水平高低，该研究将5个类群进一步定义为：促分化类、抑生长类、抑代谢类、促免疫响应类和抑细胞周期类（图3）。

类群1为促分化类，该类群的特征为不同肠道细胞类型的标志基因的表达相对其他类群较高，说明肿瘤类器官的分化特征增强。提示类群1的药物在杀伤肿瘤细胞的同时也可能通过促进细胞分化进而抑制肿瘤细胞的增殖。通过基因功能富集分析，发现该类群药物明显抑制肿瘤细胞的有丝分裂，并且抑制Wnt信号通路的表达。同时，与肠道吸收和分泌功能相关的基因CHGB、S100A9、SLC17A7和SLC8A2的表达上调。类群2为抑生长类，转录组特征为应激相关通路和代谢相关通路的干扰相对其他类群较弱，通过基因功能富集分析，发现该类群明显抑制生长因子响应通路以及MAPK信号通路。类群3为抑代谢类，转录组特征为与代谢相关通路如糖酵解通路的表达被抑制。该类群下调的基因富集在碳水化合物代谢和氨基酸代谢等功能中。类群4为促免疫响应类，其转录组特征主要表现为免疫响应和应激响应相关通路的激活。通过基因功能富集分析，发现该类群的特异性高表达基因富集在嗜中性粒细胞脱颗粒、MHC-I类分子的组装和呈递等功能。说明该类群的药物不仅杀伤肿瘤细胞，同时也可能通过增强肿瘤细胞抗原递呈的效果，释放招募免疫细胞的信号，促进免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。类群5的细胞周期等相关信号通路的表达受到抑制的程度最强，被定义为抑细胞周期类。其转录组特征表现为有丝分裂纺锤体功能被抑制、铁死亡通路激活，且肠道细胞分化相关基因的表达下调。该类群的差异低表达基因富集在细胞有丝分裂、DNA复制和细胞周期检查点等功能上。同时，与细胞周期和DNA复制功能相关的基因CDK1、CDKN3、CENPE和TOP2A的表达下调。

值得一提的是，该研究鉴定得到的抑生长类，抑代谢类和抑细胞周期类药物的相关功能被之前的肿瘤药物筛选研究认为是杀伤肿瘤细胞的药物的常见功能，而促分化类和促免疫响应类的药物除了会对肿瘤细胞直接产生杀伤作用之外，还会对肿瘤细胞产生其他特征的影响。促分化类药物还可能使肿瘤细胞朝着更加分化的状态转化，从而使肿瘤细胞更容易被杀伤。促免疫响应类药物在杀伤肿瘤细胞的同时还可能会使肿瘤细胞的抗原呈递功能增强，从而更容易招募T细胞、髓系细胞等免疫细胞对肿瘤细胞进行杀伤。促分化类和促免疫响应类的药物具有进一步研究和应用的潜在价值，相关的体内实验和临床试验需要进一步开展以证明其对肿瘤细胞的多方面影响。

根据结直肠癌类器官在药物处理之后的转录组特征，该研究将肿瘤类器官对药物的响应分为5种模式，分别为：促分化类、抑生长类、抑代谢类、促免疫响应类和抑细胞周期类。每个类群中的药物杀伤肿瘤细胞的方式各不相同，不同类群药物作用靶点和作用机制各有差别。

图3. 肿瘤类器官的药物响应转录组特征

3.免疫缺陷小鼠体内移植成瘤实验验证发现，曲美替尼（Trametinib）、硼替佐米（Bortezomib）和菲卓替尼（Fedratinib）三种药物具有治疗结直肠癌的潜在价值。

为了进一步探究候选药物在体内环境中的表现情况，该研究构建了基于类器官的小鼠异种移植模型（patient derived organoid-based xenografts, PDOX）。结合药物杀伤效果和其在临床使用中的毒性情况，该研究在每个药物响应类群中各选取了1到2种细胞杀伤效果强、临床使用毒性小的药物（共7个）在PDOX模型上进行体内抑瘤实验。通过统计处理后小鼠肿瘤的重量变化，发现经过8种药物处理后，小鼠的肿瘤质量的中位数都降低，说明与体外的筛选实验结果一致，筛选得到的药物都有潜在抑制结直肠癌肿瘤的效果。其中，除临床常用药物5氟尿嘧啶（5-Fluorouracil）之外，曲美替尼（Trametinib）、硼替佐米（Bortezomib）和菲卓替尼（Fedratinib）的抑制肿瘤的效果明显（图4）。

为了进一步验证体内环境中药物的作用效果，该研究解剖肿瘤块进行转录组测序，结果发现使肿瘤明显缩小的药物，肿瘤细胞中细胞周期等与细胞增殖相关的信号通路表达受到明显抑制，进一步验证了曲美替尼、硼替佐米和菲卓替尼可能为治疗结直肠癌的潜在药物。

图4. 7个候选药物在体内小鼠模型中的抑瘤效果

综上，该研究建立了基于人类肿瘤类器官、并且结合实验筛选和计算预测的药物筛选方法，成功筛选验证得到治疗结直肠癌的潜在候选药物。同时利用转录组测序技术揭示了候选药物的作用机制和作用模式，为结直肠癌治疗药物的发现提供了重要的数据支持，该研究对结直肠癌的临床治疗具有潜在应用价值。

北京大学生物医学前沿创新中心、北京大学生命科学学院毛雨诺博士（现山东大学基础医学院助理研究员）、博士生王维、杨经纬博士为该论文的并列第一作者。北京大学生物医学前沿创新中心汤富酬教授与北医三院普通外科付卫教授为该论文的共同通讯作者。该研究项目得到了国家自然科学基金和北京未来基因诊断高精尖创新中心的支持。

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